مطالعه ساختار و پایداري آلبومین سرم انسانی در حضور DTAB

Transcript

1 مطالعه ساختار و پایداري آلبومین سرم انسانی در حضور DTAB پادینا واثقی مغوان نایبعلی احمدي مینو شاهانی ایاد بهادري منفرد منیره عزیزي 1) مرکز تحقیقات پروتي ومیکس دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران 2) گروه بهداشت و پزشکی اجتماعی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران 3) گروه آناتومی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی ایلام چکیده تاریخ دریافت: 92/5/14 تاریخ پذیرش: 92/8/21 مقدمه: آلبومین سرم انسانی با ساختار منحصر به فرد خود به عنوان یک مولکول حامل در پلاسما می تواند به طیف وسیعی از مواد اتصال یابد و در نتیجه نقش هاي متنوعی را ایفا کند. هر گونه تغییر غیر طبیعی در ساختار و عملکرد آلبومین می تواند عواقب ناخوشایندي در پی داشته باشد. در این تحقیق اتصال لیگاندهایی چون دترجنتها( DTAB ) و قندها(گلوکز) در دماهاي 37 و 42 درجه سانتی گراد بر روي آلبومین بررسی شد. مواد و روش ها: بافر تریس آلبومین با ph نزدیک به ph بدن تهیه گردید و به منظور دناتوراسیون آن از اسیدکلریدریک استفاده شد. تکنیک مورد استفاده جهت مطالعات دناتوراسیون در این تحقیق طیف سنجی UV بود. یافته هاي پژوهش: نتایج نشان داد که با افزایش غلظت DTAB ماکزیمم جذب پروتي ین کاهش یافته غلظت 400 میلی گرم بر دسی لیتر قند سبب تغییرات قابل ملاحضه اي در جذب آلبومین سرم انسانی شده و احتمالا ساختار و عملکرد مولکول تحت تاثیر قرار می گیرد. بحث و نتیجه گیري: گلوکز علاوه بر تاثیرات زیانباري که دارد می تواند عملکرد بسیاري از مولکول ها را در خون تغییر دهد. به عنوان مثال در سطوح هورمونی انتقال داروها عناصر و یون هاي حیاتی و مورد نیاز بدن می تواند تاثیرات شگرف و مهمی داشته باشد. واژه هاي کلیدي: آلبومین سرم انسانی کاتیون DTAB گلوکز دناتوراسیون دمایی طیف سنجی UV نویسنده مسي ول: مرکز تحقیقات پروتي ومیکس دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران padinavm@gmail.com 191

2 مطالعه ساختار و پایداري آلبومین سرم انسانی در حضور -DTAB پادینا واثقی مغوان و همکاران مقدمه آلبومین سرم انسانی یکی از مهم ترین اجزاء پروتي ین هاي پلاسما می باشد تک رشته اي و غیر گلیکوزیله بوده و داراي 585 اسید آمینه است. در کبد سنتز شده و نهایتا ساختار قلبی شکل به خود میگیرد ( 1 ). غلظت این پروتي ین -4 در خون در حدود 10 7 M می باشد ( 2 ). این پروتي ین حامل قند هورمون ها داروها اسیدهاي چرب اسیدهاي آمینه و تعدادي از کاتیون ها در سیستم گردش خون می باشد. هم چنین در جداسازي رادیکال هاي آزاد اکسیژن و متابولیت هاي سمی مانند بیلی روبین نقش دارد. تنظیم فشار اسمزي خون یکی از عملکرد هاي اصلی آلبومین سرم انسانی می باشد ( 3 ). علاوه بر این آلبومین سرم انسانی به تغییر ph خون حساس می باشد و به عنوان یک بافر در تنظیم ph خون ایفاي نقش می کند ( 4 ). از نظر محتواي ساختمانی داراي 67 درصد ساختار α هلیکس بوده و فاقد صفحات β می باشد ( 5 ). این پروتي ین از سه دمین مشابه تشکیل شده است. حداقل 6 ناحیه در آلبومین سرم انسانی براي پیوند شدن غیر کووالانسی مولکول هاي کوچک و یون ها وجود دارد. آلبومین داراي توانایی تغییر ساختار در حضور و عدم حضور لیگاند می باشد. هر ناحیه از آلبومین در ضمن پیوند شدن لیگاندها می تواند تغییر ساختار دهد ( 6 ). گلوکز نیز یکی از موادي است که به وسیله آلبومین سرم انسانی در خون حمل می شود. بر اساس معیار تشخیصی انجمن دیابت آمریکا قندخون ناشتاي بالاي 110 میلی گرم بر دسی لیتر در دو بار متوالی دیابت تلقی می شود. در غیاب انسولین و یا در صورت مقاومت به انسولین غلظت قندخون افزایش می یابد و تمامی عوارض دیابت به علت تا ثیر قندخون بر روي عروق بافت هاي مختلف است ( 7 ). از آن جا که حامل قندخون آلبومین سرم انسانی می باشد اهمیت مطالعه تاثیرات قندخون بر ساختار پروتي ین در کنار عوامل دیگري چون تغییرات دمایی و یا حضور لیگاندهاي دیگر آشکار می شود. مواد و روش ها به منظور تهیه بافري با ph نزدیک به ph بدن gr 75/3 پودر بافر تریس به 400 CC آب مقطر اضافه گردید( ph10 ) سپس با اضافه کردن تدریجی HCl به محلول ph تا 5/7 کاهش داده شد و پس از آن 100 CC آب مقطر به محلول اضافه گردید تا به این ترتیب حجم نهایی به 500 CC برسد. آلبومین سرم انسانی(- A HSA, (1887, Lot. No , fatty acid free از شرکت سیگما آمریکا خریداري شد و پس از آماده سازي بیشتر مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از این آلبومین و محلول بافر نمونه اي با غلظت 1- Mgml 0/7 براي -4 آزمایشات با غلظتM 10 تهیه گردید. کاتیون DTAB که غلظت هاي مختلف( 0 و 0,5 و 1/5 و 2 میلی مولار) تهیه گردید. 0/5 گرم گلوکز با آب مقطر به حجم 2 ml رسانده شد جهت برداشت غلظت هاي متفاوت گلوکز( و 400 میلی گرم بر دسی لیتر) حجم هاي مختلفی از این نمونه به محلول آلبومین انکوبه شده با DTAB اضافه گردید. از آن جا که هدف استفاده از روش اسپکتروفتومتري UV-Visible به دست آوردن طیف جذبی آلبومین است از خاصیت اسیدآمینه هاي آروماتیک آلبومین در جذب فوتون هایی با طول موج 280 nm استفاده گردید. در این مرحله بعد از پنج دقیقه انکوباسیون DTAB و گلوکز با آلبومین با استفاده از این دستگاه فوتون هایی با طول موج هاي nm به نمونه داده شد و جذب ماکزیمم اندازه گیري شد. با استفاده از این روش غلظت هاي DTAB و گلوکز با HSA مورد بررسی قرار گرفت و در دماي 37 و 42 درجه سانتی گراد سه بار تکرار گردید. یافتههاي پژوهش طیف هاي UV آلبومین سرم انسانی انکوبه شده با کاتیون DTAB و غلظت هاي مختلف قند در دماهاي 37 و 42 درجه سانتی گراد به ترتیب در شکل هاي شماره 1 و 2 ترسیم شده اند. شکل شماره 1 ماکزیمم جذب آلبومین سرم انسانی انکوبه شده با کاتیون DTAB در حضور غلظت هاي مختلف قند در دماي 37 درجه سانتی گراد می باشد. 192

3 شکل شماره 1. جذب طول موج 280 نانومتر آلبومین سرم انسانی در حضور غلظت هاي مختلف گلوکز در دماي 37 درجه سانتی گراد به عنوان تابعی از غلظت DTAB در بافر فسفات نیم میلی مولار و ph=7 هم چنین شکل شماره 2 ماکزیمم جذب آلبومین سرم انسانی انکوبه شده با کاتیون DTAB در حضور غلظت هاي گراد می باشد. مختلف قند در دماي 42 درجه سانتی شکل شماره 2. جذب طول موج 280 نانومتر آلبومین سرم انسانی در حضور غلظت هاي مختلف گلوکز در دماي 42 درجه سانتی گراد به عنوان تابعی از غلظت DTAB در بافر فسفات نیم میلی مولار و ph=7 بحث و نتیجهگیري همان طور که مشاهده می شود در دو غلظت 175 و 100 میلی گرم بر دسی لیتر قند جذب بیشینه در غلظت 0/5 میلی مولار از DTAB رخ داده است و این در حالی است که در غلظت قند 400 میلی گرم بر دسی لیتر جذب بیشینه در غلظت 1 میلی مولار از DTAB حاصل شده است. با افزایش غلظت DTAB ماکزیمم جذب پروتي ین کاهش یافته است. با توجه به شکل ماکزیمم جذب در غلظت 0/5 میلی مولار DTAB و شرایط نرمال قندخون 100 میلی گرم بر دسی لیتر و شروع هایپرگلایسمی با غلظت قند 175 میلی گرم بر دسی لیتر به ترتیب 325 و 316 نانومتر می باشد و این در حالی است که ماکزیمم جذب در غلظت 1 میلی مولار DTAB و شرایط دیابت با غلظت قند 400 میلی گرم بر دسی لیتر تا 278 نانومتر کاهش محسوسی نشان می دهد. هم چنین با افزایش غلظت قند تمایل پروتي ین به کاتیون DTAB بیشتر شده است. در شکل شماره 2 همان طور که مشاهده می شود پروتي ین در غلظت 400 میلی گرم بر دسی لیتر قند ماکزیمم جذب را در غلظت بیشتري از DTAB حاصل می کند. به طوري که ماکزیمم جذب پروتي ین در غلظت 175 میلی گرم بر دسی لیتر قند در غلظت 1 میلی مولار DTAB و در غلظت 400 میلی گرم بر دسی لیتر قند در غلظت 1/5 میلی مولار DTAB دیده می شود. از طرفی با توجه به شکل شماره 2 در دماي 42 درجه سانتی گراد نیز مانند دماي فیزیولوژیک با افزایش غلظت DTAB ماکزیزمم جذب پروتي ین کاهش یافته است زیرا ماکزیمم جذب غلظت 100 میلی گرم بر دسی لیتر قند در 330 نانومتر بوده و این رقم در غلظت 400 میلی گرم بر دسی لیتر قند به 286 نانومتر نزول پیدا کرده است. هم چنین همانند شکل شماره 1 با افزایش غلظت قند تمایل پروتي ین 193

4 مطالعه ساختار و پایداري آلبومین سرم انسانی در حضور -DTAB پادینا واثقی مغوان و همکاران به کاتیون DTAB بیشتر شده است. با افزایش غلظت قندخون ماکزیمم جذب غلظت 175 میلی گرم بر دسی لیتر قند در غلظت 1 میلی مولار DTAB حاصل شده و با افزایش غلظت قندخون به 400 میلی گرم بر دسی لیتر ماکزیمم جذب در غلظت 1/5 میلی مولار از DTAB دیده می شود. با توجه به این که در هر دو دماي 37 و 42 درجه سانتیگراد تمایل پروتي ین به کاتیون با افزایش غلطت قندخون افزایش یافته است می توان گفت اگر کاتیون DTAB را به لحاظ داشتن یک بار مثبت به + Na تشبیه کنیم می توان گفت در افراد مبتلا به دیابت مصرف نمک طعام از حساسیت بیشتري برخوردار است چرا که آلبومین تمایل بیشتري به نمک پیدا کرده و این موضوع شخص را مستعد ابتلا به فشارخون و متعاقبا بیماري هاي قلبی- عروقی خواهد کرد. بیش از 50 درصد مبتلایان به دیابت نوع 2 به بیماري فشارخون مبتلا هستند ( 8 ). در مبتلایان به دیابت نوع یک این درصد در ابتدا و در سنین پایین به مراتب کمتر است و تدریجا با افزایش سن بیشتر می شود ( 9 ). فشارخون بالا دیابت را تشدید و دیابت فشارخون را بدتر می کند و تنها راه کنترل این دو درمان توأمان و هم زمان آن هاست. هر چه فشارخون بیمار دیابتی بهتر کنترل شود خطر بروز سکته هاي قلبی و مغزي ضایعات چشمی و کلیوي و عروقی و اعصاب محیطی در او کمتر می شود و برعکس. لذا توجه به این مسي له از اهمیت فراوانی برخوردار است ( 10 ). با توجه به اطلاعات حاصل از شکل هاي 1 و 2 قند با غلطت 400 میلی گرم بر دسی لیتر می توان گفت جایگاه هاي فعال آلبومین سرم انسانی فرد مبتلا به دیابت که دچار تب شده است تمایل به کاتیون دارد. در نتیجه می توان گفت این افراد بیشتر در معرض ابتلا به فشارخون و عوارض ناشی از آن قرار دارند. هم چنین با توجه به نتایج منتشر شده در مجله دیابت و لیپید ماکزیمم جذب آلبومین گلایکه شده با غلظت بالاي قند در مقایسه با ماکزیم جذب آلبومین انکوبه شده با DTAB و قند به غلظت 400 میلی گرم بر دسی لیتر نشان می دهد پایداري پروتي ین در حالتی که تنها با غلظت بالاي قند انکوبه شده است بیشتر از زمانی است که کاتیون نیز به آن ها می پیوندد. این موضوع نشان می دهد که آلبومین فرد دیابتی اي که از نمک کمتري در رژیم غذایی خود استفاده می کند در وضعیت پایدارتري قرار دارد نسبت به فردي که رژیم غذایی پر نمکی دارد. این مهم باعث می شود افرادي با رژیم غذایی کنترل شده و مبتلا به دیابت کمتر در معرض بروز بیماري هاي جانبی مانند فشارخون بیماري هاي قلبی و عروقی نارسایی هاي کلیوي و بیماري هاي اتوایمیون مانند پسوریاز آرتریت روماتوي ید ام اس و اسپوندیلیت آنکلیلوزان شوند چرا که هافلر و همکاران دریافتند نمک در ایجاد بیماري هاي خودایمنی مانند «دیابت نوع یک» نقش دارد ( 11 ). این پژوهش نشان می دهد که غلظت 400 میلی گرم بر دسی لیتر قند سبب تغییرات قابل ملاحضه اي در جذب آلبومین سرم انسانی شده است و احتمالا ساختار و عملکرد مولکول تحت تاثیر قرار می گیرد. آن گونه که از نتایج حاصله بر می آید گلوکز علاوه بر تاثیرات زیانباري که دارد می تواند عملکرد بسیاري از مولکول ها را در خون تغییر دهد. به عنوان مثال این مهم در سطوح هورمونی انتقال داروها عناصر و یون هاي حیاتی و مورد نیاز بدن می تواند تاثیرات شگرف و مهمی داشته باشد. References 1- Rezaei-Tavirani M, Mahdavi SM, Heidarian E.Electrochemical study of attaching the active substance HPB to human serum albumin. J Ilam Uni Med Sci 2006; 4: (Persian) 2- Fasano M, Curry S, Terreno E, Galliano M, Fanali G, Narciso P, et al. The extraordinary ligand binding properties of human serum albumin, IUBMB Life 2005; 57: Curry S. Lessons from the crystallographic analysis of small molecule binding to human serum albumin. Drug Metab Pharmacokinet 2009; 24: Peters Jr T. All about albumin: biochemistry, genetics and medical applications. Academic Press:San Diego and London; Curry S. Beyond expansion: structural studies on the transport roles of human serum albumin. Vox Sang 2002; 83: Lockridge O, Xue W, Gaydess A, Grigoryan H, Ding SJ, Schopfer LM, et al. Pseudo-esterase activity of human albumin: slow turnover on tyrosine 411 and stable acetylation of 82 residues including 59 lysines. J Biol Chem 2008;283: Maraschin Jde F. Classification of diabetes. Adv Exp Med Biol 2012; 771: The Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pre-- 194

5 ssure. National Heart, Lung and Blood Institute; Sicras AM. Clinical and economic characteristics associated with type 2 diabetes. Rev Clin ESP 2013; 17: Sowers R, Epstein M. Diabetes Mellitus and Associated Hypertension, Vascular D- isease, and Nephropathy. Am Heart Assoc J 1995; 26: Muller N, Hafler A. Sodium chloride drives autoimmune disease by the induction of pathogenic TH17 cells. Nature 2013; 21: Evaluating Human Serum Albumin Structure and Stability in the Presence of DTAB Vaseghimaghvan P 1*, Ahmadi N 1, Shahani M 1, BahadoriMonfared E 2, Azizi M 3 Recived: 5August, 2013 Accepted: 12November, 2013 Abstract Introduction: Human serum albumin with its singular structure acts as a carrier molecule that can attach to a variety of substances. Any structural or functional changes in albumin are accompanied with undesirable outcomes. In the present research, attachment of some ligands such as detergents (DTAB) and sugars (glucose) to albumin were evaluated at temperatures 27 C and 42 C. Materials & Methods: Tris-buffer solusion for albumin with a ph close to the ph of body was prepared. To denature albumin, hydrochloric acid was used. UV specterophotometric technique was applied to evaluate denaturation process. Findings: With increment of DTAB concentration the maximum optical absorption of albumin decreased. Glucose concentration at 400mg/dl level caused a profound change in the optical absorption of albumin that might affect the structure of the molecule. Discussion & Conclusion: Glucose elevateon has deleterious effects and deteriorates the function of many molecules in blood. The effects may exert on hormones, drug transportation, necessary ions and elements Keywords: Human serum albumin, DTAB cation, glucose, thermal denaturation, UV spectrophotometry 1.Proteomic Research Center, Faculty of Paramedicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran 2.Dept of Health and Social Medicine, Faculty of Paramedicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran 3.Dept of Anatomy, Faculty of Medicine, Ilam University of Medical Sciences, Ilam, Iran *Corresponding author Scientific Journal of Ilam University of Medical Sciences 195